PCR儀操作步驟
2012-06-19
PCR的反應包括三個主要步驟：分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱變性， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶 e.g. Taq-polymerase 的作用下進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。
PCR技術神奇就神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子就可以用于擴增了;二是擴增效率高，幾個小時就擴增1000萬倍以上。現(xiàn)在PCR技術已經(jīng)被廣泛地應用于生命科學研究、食品衛(wèi)生、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術!
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實現(xiàn)
1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片
段，其缺點是：
?、貹lenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。
?、谝镦溠?/p>
伸反應在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的
DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，
但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成
一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內(nèi)沒能引
起生物醫(yī)學界的足夠重視。
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較
高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種
耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的
90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40
%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異
性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也
大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶Taq DNA
Polymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應用。
獲得諾貝爾獎的PCR技術
1995年，美國科學家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎，他所取得的成就是發(fā)明了PCR技術。
PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應，其實是一種DNA的快速擴增技術，其擴增效率之高就象核裂變的“鏈式反應”那樣。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內(nèi)把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術一問世，立刻引起了分子生物學研究的一場革命，人們利用這種轟動全世界的技術很快就把微觀領域的生物學研究大大地往前推了一步。可以這么說，PCR技術使分子生物學研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術的日趨完善，PCR在人類社會生活中的應用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋”中我們提到，科學家們只需要一根頭發(fā)甚至一個細胞就可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上就要采用PCR技術，因為一個細胞中的DNA含量實在太少了，人們根本不可能檢測到它的指紋;有了PCR技術就好辦了，通過PCR技術把這個細胞中的DNA片斷擴增1000萬倍，這樣DNA量就足夠作指紋鑒定了。再比如，在醫(yī)院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少(例如有的艾滋病病毒攜帶者)，通過傳統(tǒng)的檢查方法費力又費時，這時PCR技術也許就可以幫上忙?？梢韵冗x定這種病毒DNA上的一段DNA，設計合適的引物DNA，然后通過PCR技術一擴增很快就可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的話，那么就說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應，省時省力效率高。
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