如何選擇合適的定量PCR儀
2012-06-19
定量PCR儀主要由兩部分組成，一個(gè)是PCR系統(tǒng)，一個(gè)是熒光檢測系統(tǒng)。從生物通前面的原理介紹不難看出選擇定量PCR儀的關(guān)鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比來實(shí)現(xiàn)定量的，對于定量PCR系統(tǒng)來說，重要的參數(shù)除了傳統(tǒng)PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數(shù)級放大。至于熒光檢測系統(tǒng)，多色多通道檢測是當(dāng)今的主流趨勢——儀器的激發(fā)通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時(shí)檢測一個(gè)樣品中的多種熒光，儀器就可以同時(shí)檢測單管內(nèi)多模版或者內(nèi)標(biāo)+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強(qiáng)大。熒光檢測系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測器。激發(fā)光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發(fā)光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長，而單色發(fā)光二極管LED價(jià)格低、能耗少、壽命長，不過因?yàn)槭菃紊?，需要不同的LED才能更好地實(shí)現(xiàn)不同激發(fā)波長。監(jiān)測系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點(diǎn)成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，需要通過逐個(gè)掃描實(shí)現(xiàn)多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時(shí)間。定量PCR儀需要考慮的另外一個(gè)因素是軟件設(shè)計(jì)，這一點(diǎn)目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規(guī)使用。——隨著定量PCR技術(shù)在臨床診斷、疾病監(jiān)控、藥物監(jiān)測、腫瘤研究等領(lǐng)域的越來越廣泛的應(yīng)用，市面上不同品牌和設(shè)計(jì)的定量PCR儀也不斷推陳出新，生物通在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩。
1. 傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀
傳統(tǒng)的96孔板式定量PCR儀以美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)為代表。傳統(tǒng)96孔板式定量PCR儀的優(yōu)點(diǎn)是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材，可以采用傳統(tǒng)的96孔板甚至384孔板進(jìn)行批量的定量反應(yīng)，但是缺點(diǎn)也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應(yīng)——樣品槽上每個(gè)孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應(yīng)(可參考生物通龍虎榜：PCR儀的選擇一文)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對于靈敏度極高的定量PCR來說，任何極微小的差異都會以指數(shù)級別的規(guī)模被放大，不能不說是一種缺憾。傳統(tǒng)反應(yīng)板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對較慢，因而反應(yīng)速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統(tǒng)，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個(gè)樣品孔距離光源和監(jiān)測器的光程各不相同，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。檢測在試管管底進(jìn)行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。
ABI的7500型熒光定量PCR儀激發(fā)光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時(shí)激發(fā)96個(gè)樣品，超低溫CCD具備同時(shí)多點(diǎn)多色檢測的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express非常有用，“因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針(生物通摘自ABI技術(shù)資料)”。各型號都有實(shí)時(shí)動態(tài)(Real-Time)和終點(diǎn)讀板(Plate Read)兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動態(tài)模式用于定量DNA或RNA拷貝數(shù)?？梢詣討B(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個(gè)數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析等。當(dāng)然，也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀最大的優(yōu)勢在于ABI已經(jīng)發(fā)布十二萬種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達(dá)分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬個(gè)基因，二百萬種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測試劑盒，為運(yùn)用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。7500型號比7300多一個(gè)濾光鏡，新的光路設(shè)計(jì)使長波長紅色熒光的檢測靈敏度大大提高，帶有快速運(yùn)行模式。增強(qiáng)的7900型在96孔模塊的基礎(chǔ)上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數(shù)據(jù)的能力大大增強(qiáng)，應(yīng)該更適合經(jīng)常處理大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室吧。
MJ的Option系列是在MJ原來的常規(guī)PCR儀基礎(chǔ)上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒光檢測器。 96個(gè)單色LED光源對應(yīng)96孔板，但是單色LED激發(fā)波長范圍較窄。Option是單道單個(gè)光電倍增管熒光檢測器，升級的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個(gè)樣品，所以O(shè)ption系列是逐孔掃描而非同時(shí)檢測96個(gè)樣品。雙PMT可同時(shí)進(jìn)行雙色檢測(FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。優(yōu)勢之一是帶梯度功能。Bio-Rad(伯樂)也算是個(gè)熟悉的品牌，iCycler iQ實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測波長范圍400-700nm，可4波長同時(shí)檢測，儀器的設(shè)計(jì)靈活，定性和定量部分可獨(dú)立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測波長。專利技術(shù)intensifier熒光放大器保證了極高的檢測靈敏度。MJ被Bio-Rad收購后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來Bio-Rad會如何決定二者的發(fā)展方向還需要拭目以待。
2.創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀
為了克服平板式定量pcr溫度均一性差的缺點(diǎn)，聰明的研究人員又開發(fā)出創(chuàng)新概念的離心式實(shí)時(shí)定量pcr儀，以roche羅氏的lightcycle和corbett的rotor-gene為代表。pcr擴(kuò)增樣品槽被巧妙地設(shè)計(jì)為離心轉(zhuǎn)子的模樣，借助空氣加熱和轉(zhuǎn)子在腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)子上每個(gè)孔都是“等位”的，幾乎無差別，很好的解決了每個(gè)樣品孔之間的溫度均一性的關(guān)鍵問題——corbett的rotor-gene樣品間溫度差異小于±0.01℃，最大程度地保障了標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)在于能實(shí)現(xiàn)與反應(yīng)體系無縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競爭對手批評空氣介質(zhì)比熱小，但事實(shí)上roche的lightcycle%202.0卻是目前升溫速度最快的定量pcr儀，可以達(dá)到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以達(dá)到5℃/秒(樣品實(shí)際升溫速度達(dá)到2.5℃/秒)，優(yōu)于多數(shù)的平板式PCR儀。借助旋轉(zhuǎn)離心力還可以隨時(shí)將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無需熱蓋;還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應(yīng)體系混合，實(shí)現(xiàn)“機(jī)械的熱啟動功能”。由于升溫速度快，對于常規(guī)需要2個(gè)多小時(shí)完成的定量PCR反應(yīng)，Roche的LightCycler僅需20—30分鐘即可完成，可以大大節(jié)約時(shí)間和提高工作效率。這一點(diǎn)對于研究人員來說極為有用，因?yàn)槟悴辉傩枰?個(gè)多小時(shí)才能看實(shí)驗(yàn)結(jié)果了，或者換句話來說，2個(gè)多小時(shí)你可以做4—5輪定量實(shí)驗(yàn)了。
由于轉(zhuǎn)子上的樣品孔是旋轉(zhuǎn)可移動的，因而離心式熒光檢測系統(tǒng)可以固定激發(fā)光源和熒光檢測器，隨時(shí)檢測旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品管——由于每個(gè)樣品管在檢測時(shí)距離檢測器和激發(fā)光源的距離都是“等價(jià)”一樣的，使用的是同一個(gè)檢測器和激發(fā)光源，有效減少不必要的系統(tǒng)誤差。固定的結(jié)構(gòu)使得儀器運(yùn)行更穩(wěn)定，使用壽命更長;離心式定量PCR都是逐個(gè)檢測樣品的，所以大多采用了長壽的LED(發(fā)光二極管)冷光源，運(yùn)行前無須預(yù)熱，無須校正;系統(tǒng)檢測重復(fù)性也更好。
離心式定量PCR儀的缺點(diǎn)主要是離心的轉(zhuǎn)子小，能容納的樣本量有限，由于是離心式轉(zhuǎn)子，常規(guī)的96孔板和條形管就不適用，有的還需要特殊的消耗品，增加使用成本。當(dāng)然離心式定量PCR儀不可能帶梯度功能。
Roche的Lightcycler剛推出的時(shí)候確實(shí)讓人眼前一亮!現(xiàn)在Lightcycler2.0擁有令人心動的優(yōu)點(diǎn)-----
快速：利用空氣動力學(xué)原理，20-30分鐘內(nèi)完成30-40個(gè)循環(huán)。
控溫準(zhǔn)確：變溫速率最高可達(dá)20℃/秒，溫差≤±0.3°C
多波長檢測：可同時(shí)在530、640及710nm三個(gè)通道進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)同管檢測兩個(gè)項(xiàng)目或設(shè)立檢測項(xiàng)目的外對照和內(nèi)對照。
此外動態(tài)檢測范圍達(dá)10個(gè)數(shù)量級，而無須將樣品稀釋;具有熔點(diǎn)曲線分析功能可以鑒別基因型、檢測點(diǎn)突變、檢測非特異性擴(kuò)增，具多種檢測模式如Taqman探針、熒光染料SYBR Green I檢測、序列特異雜交探針等;探針及引物設(shè)計(jì)方便，雜交探針及引物設(shè)計(jì)的限制少，而且亦可方便地選用合適大小的擴(kuò)增子(100-1000bp)。但是Lightcycler需要使用特定的毛細(xì)管作為樣品管，這在某種程度上提高了消耗成本，也不方便作為常規(guī)PCR儀使用。
Corbett的Rotor-Gene也是離心式的定量PCR儀。在品牌的角度上Corbett當(dāng)然不如Roche羅氏在國內(nèi)那樣家喻戶曉，之所以特別提到這個(gè)產(chǎn)品，確實(shí)是因?yàn)镃orbett的設(shè)計(jì)有獨(dú)到之處。比如Corbett的Rotot-Gene3000標(biāo)準(zhǔn)型是真正獨(dú)立的4通道(可建立新通道)，4個(gè)獨(dú)立LED激發(fā)光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保證最少的光譜交叉 (<1 %)。PMT檢測，6個(gè)檢測濾光片，可檢測熒光包括FAM/SYBR Green I, TET，VIC/JOE，HEX，Max， NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5，Cy5.5等等，機(jī)器的適用性非常寬，開放的試劑系統(tǒng)使得機(jī)器可適用Taqman探針、熒光染料SYBR Green I檢測、分子信標(biāo)、FRET探針、Amplifluor探針等等，不像某些牌子的定量PCR儀只能適用Taqman法和熒光。Rotot-Gene3000靈敏度高，寬達(dá)12個(gè)數(shù)量級的線性范圍，可正確區(qū)分1、2、3拷貝的基因，重復(fù)性極佳(R>0.99935)。由于轉(zhuǎn)子在反應(yīng)過程之中一直以恒定的低速旋轉(zhuǎn)，使得樣品間的溫度均一性極佳(±0.01℃/秒)，同一熱反應(yīng)室提供完全相同的反應(yīng)條件，同一光學(xué)通路提供完全相同的測量通道，每標(biāo)本每循環(huán)檢測32次，滿足高精度和一致性要求。Rotot-Gene3000提供了36 x0.2ml和72x0.1ml兩種轉(zhuǎn)子，檢測是通過薄壁管側(cè)壁而非管底進(jìn)行的，因而可以使用普通的0.2ml PCR管，并允許在試管蓋上標(biāo)記，這降低了使用成本。Rotot-Gene3000的溫控速度不如LightCycler，但優(yōu)于多數(shù)的固定加熱模塊的機(jī)型，能達(dá)到5℃/秒(管內(nèi)實(shí)際升溫速度達(dá)到2.5℃/秒)。Corbett還有一個(gè)光學(xué)變性專利——讓待擴(kuò)增樣品預(yù)先進(jìn)行一次熔解曲線程序，檢測熒光染料信號大小的變化，找到代表全部雙鏈DNA解鏈的峰值對應(yīng)溫度，在其后的反應(yīng)中就無需總是將變性溫度設(shè)為94度，也不需要延長孵育時(shí)間。這個(gè)專利使得反應(yīng)過程大大縮短。Rotot-Gene主要的問題也是可容納的樣品數(shù)量少，只能靠反應(yīng)速度快，同樣的時(shí)間可以多運(yùn)行幾輪反應(yīng)來彌補(bǔ)。對于大量樣品的實(shí)驗(yàn)室，Corbett同時(shí)還提供定量PCR反應(yīng)自動加樣系統(tǒng)，不單可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套Roche和ABI的定量PCR儀。這樣就不用擔(dān)心加樣累壞了。
3.第三類的熒光定量pcr儀以cepher公司的smart%20cyclerii為代表，對于國內(nèi)的用戶來說比較新鮮，但這個(gè)一直受美國國防部和安全局、美國軍隊(duì)傳染病醫(yī)學(xué)研究中心、美國軍隊(duì)士兵和生物化學(xué)合作所資助的公司卻相當(dāng)有來頭。smart%20cyclerii獲得過1998年美國研發(fā)r&d100金獎。smart%20cyclerii的機(jī)型小巧，只有16個(gè)樣品槽，它的獨(dú)到之處在于這16個(gè)樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，也就是說這16個(gè)樣品槽相當(dāng)于16臺獨(dú)立的定量pcr儀!獨(dú)立控溫的好處首先是，你可以在同一定量pcr儀上分別進(jìn)行不同條件的定量pcr反應(yīng)，更為靈活自定義的梯度優(yōu)化反應(yīng)也好，或者是完全不同的幾組反應(yīng)——甚至，你可能只進(jìn)行個(gè)別樣品的檢測，只占用其中幾個(gè)樣品槽——過一會兒其它的同事也要用——他不需要等待你的反應(yīng)結(jié)束，而可以隨時(shí)利用空置的樣品槽開始其它定量反應(yīng)!對于各有各忙的多成員的實(shí)驗(yàn)室，要是個(gè)別樣品就占據(jù)96孔樣品槽，其它人每輪要再等2個(gè)多小時(shí)，有時(shí)還要等幾輪，那可夠郁悶的。smart%20cycler%20ii的使用頻率可以被最大化，大家都不用等待!這個(gè)世界上唯一允許不同條件pcr同時(shí)進(jìn)行的定量pcr儀擁有獨(dú)一無二的優(yōu)點(diǎn)，是其它任何平板式或者離心式定量pcr都不具備的。
此外，每個(gè)溫控模塊只控制一個(gè)樣品槽，升降溫速度當(dāng)然更快——高達(dá)10℃/秒，控溫精度自然就更高——這里根本不用考慮不同樣品槽之間的溫度均一性的問題，只有每個(gè)模塊控溫精確度的問題。對于普通的96孔板固定加熱模塊，本身有控溫精度和準(zhǔn)確度的差異，再加上樣品槽不同位置之間的溫度差異，而Smart CyclerII就完全減少了一個(gè)誤差因素。優(yōu)異的特性使得只要20分鐘就可以完成常規(guī)的定量PCR反應(yīng)，大大提高研究人員的工作效率。每個(gè)模塊獨(dú)立控制的激發(fā)光源和檢測器直接與反應(yīng)管壁接觸，保證熒光激發(fā)和檢測不受外界干擾，固定的結(jié)構(gòu)使得儀器運(yùn)行更穩(wěn)定，使用壽命更長。整合有4通道光學(xué)檢測系統(tǒng)，分別可以檢測FAM/SYBR Green I, Tet/ Cy3, Texas Red和Cy5，可在同一樣本中進(jìn)行多靶點(diǎn)分析，同時(shí)檢測4種熒光信號，可使用多種檢測方法，包括Taqman探針、分子信標(biāo)、Amplifluor引物和Scorpion引物和熒光內(nèi)插染料等等。寬達(dá)9個(gè)數(shù)量級的線性范圍。
不過Smart CyclerII需要使用獨(dú)家的扁平反應(yīng)管，增加了反應(yīng)成本，上樣也不如傳統(tǒng)的方法方便，而且16個(gè)樣品槽也不大適合批量反應(yīng)的要求——不過Smart Cycler II的軟件設(shè)計(jì)允許一臺電腦同時(shí)操作6臺Smart Cycler II，部分彌補(bǔ)了缺憾。所以Smart Cycler II會更適合多成員、樣本量不大、要求快速出結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室。不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都總是要同時(shí)檢測幾十上百個(gè)樣品吧?
在選購定量PCR前之前我們需要先了解自己的需要——是同時(shí)檢測大量樣本?還是小規(guī)模的研究?是固定的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法還是有機(jī)會嘗試不同的方法?隨著技術(shù)的加速發(fā)展不斷有新的熒光素、標(biāo)記方法和試劑盒面市，還要考慮儀器性能在將來的可拓展性等等。生物通撰寫本文的目的并非指出哪一類的儀器更適合我們的需要——畢竟不同應(yīng)用領(lǐng)域、不同的實(shí)驗(yàn)室有著不同的需求，所以了解不同類型的定量PCR儀的特點(diǎn)有助于選擇更適合自己需要的儀器，“不求最好，但求適合”。
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